文书库 > 专业文章 > 柳暗花明又一村——研究的乐趣(我的论文)

柳暗花明又一村——研究的乐趣(我的论文)

来源:王俊飞、董亮 南山呼吸 编辑:劳琴 2018-07-31 |
0
摘要:
我们课题组联合悉尼大学Woolcock呼吸病研究所细胞生物组研究团队于2018年1月29日在Journal of Cellular and Molecular Medicine杂志发表了一篇题为Unique mechanisms of connective tissue growth factor regulation in airway smooth muscle in asthma: Rela

王俊飞、董亮介绍-柳暗花明又一村——研究的乐趣(我的论文)

血管生成是哮喘气道重塑的重要特点,而CTGF在血管生成过程中起到重要作用,因此我们认为研究CTGF的调节对哮喘气道重塑具有重要意义,可为哮喘的治疗提供新的靶点。

我们前期的体外研究发现,经TGF-β刺激后,CTGF在哮喘气道平滑肌细胞中的表达远远高于非哮喘细胞(图1),而出现这一结果的机制尚未有人研究,因此我们提出“CTGF在哮喘与非哮喘气道平滑肌细胞中的调节存在差异”的假说。

反观其他课题组在其他细胞系中关于CTGF调节的研究及相关文献报道,我们也发现CTGF主要是在转录及转录后水平调节的,据此我们进行了相关研究。

CTGF在哮喘气道平滑肌细胞中的表达远远高于非哮喘细胞(图1)

图1  哮喘气道平滑肌细胞中CTGF表达较非哮喘增加
哮喘和非哮喘病人来源的气道平滑肌细胞给予TGF-β1(1 ng/mL)刺激0~72h。CTGF mRNA(A,非哮喘 n = 7,哮喘n = 5)及蛋白(B,非哮喘n = 4,哮喘n = 7)的水平采用实时定量PCR和western blot测定。CTGF western blot条带通过Carestream MI SE量化分析(C)。*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,*表示牛血清蛋白对照组与TGF-β1刺激组存在统计学意义上的显著差异。#P<0.05, ##P<0.01, ####P<0.0001, #表示非哮喘组与哮喘组存在统计学意义上的显著差异。

在转录水平上,我们将CTGF启动子荧光素酶报告克隆质粒转染原代非哮喘及哮喘病人来源的气道平滑肌细胞后加入TGF-β1刺激,并进行荧光素酶的测定,进而确定CTGF启动子在哮喘及非哮喘气道平滑肌细胞中的活化水平。

虽然已有文献报道小鼠成纤维细胞、人血管平滑肌细胞中TGF-β诱导的CTGF是由CTGF启动子中转录因子结合位点与相应转录因子的结合来调节,但是我们在气道平滑肌细胞中并未发现CTGF启动子区域存在TGF-β调节位点(图2)。

我们通过Encode数据库查询了CTGF基因的转录调节相关区域,发现在气道平滑肌细胞的相关信息是缺失的,但是存在肺成纤维细胞及人脐静脉内皮细胞的转录调节相关区域,通过对比发现这两种细胞中参与CTGF转录调节的区域是不同的,由此我们认为,虽然在其他细胞类型中CTGF的转录调节主要是启动子调节,但是不同的细胞类型,其调节区域是有区别的。

鉴于气道平滑肌细胞和肺成纤维细胞中CTGF表达水平及经TGF-β刺激后表达的相似性,我们认为气道平滑肌细胞中转录调节不位于启动子区域(-1500bp—0),而位于远离启动子的另一段区域中(-4200bp—-2400bp)(图3)。

 

图2  基础CTGF启动子调节在哮喘与非哮喘气道平滑肌细胞中相同

图2  基础CTGF启动子调节在哮喘与非哮喘气道平滑肌细胞中相同
A. CTGF启动子荧光素酶报告克隆质粒及5’端缺失突变质粒示意图。不同长度的人CTGF启动子(-1500到+200bp,
)位于荧光素酶基因(Gluc,)的上游。分泌性碱性磷酸酶(SEAP)基因存在同一质粒中,通过CMV启动子调节,用于转染效率的测定。非哮喘(B,n = 5)和哮喘(C,n = 5)平滑肌细胞转染及TGF-β1刺激后,荧光素酶活性采用试剂盒测定。&P<0.05,&&P<0.01,&&&P<0.001,&表示与空白质粒(0)相比,荧光素酶的表达升高。

 

图3 道平滑肌细胞中转录调节不位于启动子区域(-1500bp—0),而位于远离启动子的另一段区域中(-4200bp—-2400bp)

图3 A.通过染色质免疫共沉淀测序明确的人的肺成纤维细胞、HUVECs中CTGF基因附近的H3K27ac特点;

B.用于本研究CTGF启动子质粒的示意图;C.已经在其他细胞类型中证实的Smad和TGF-β转录因子结合

而转录后调节,我们主要侧重于CTGF mRNA稳定性的研究。

 

加入Actinomycin D刺激哮喘和非哮喘气道细胞终止细胞中mRNA的合成,通过测定细胞中剩余CTGF mRNA的表达量来测定其mRNA在哮喘和非哮喘气道平滑肌细胞中的半衰期和稳定性。

结果显示,哮喘气道平滑肌细胞中CTGF mRNA的半衰期远远高于非哮喘细胞,也就是说CTGF mRNA在哮喘气道平滑肌细胞中更稳定(图4)。

图4  哮喘气道平滑肌细胞中CTGF mRNA的稳定性增强

图4  哮喘气道平滑肌细胞中CTGF mRNA的稳定性增强
TGF-β(1 ng/mL)刺激非哮喘(n = 4)和哮喘(n = 5)气道平滑肌细胞8h后,加入actinomycin D(10 ng/mL)刺激0~16h的表达通过实时定量PCR测定。*P<0.05,***P<0.001,****P<0.0001,*提示CTGF mRNA的表达与0 h相比具有统计学意义。#P<0.05表示CTGF mRNA在非哮喘和哮喘气道平滑肌细胞中的差异具有统计学意义。

 

深陷迷局

我们的研究结果首次揭示了CTGF在原代气道平滑肌细胞中的调节机制,研究成果是让人兴奋和喜悦的,但研究的过程却是曲折的。在本课题中,遇到研究瓶颈时候的迷茫、解决问题过程的艰辛及取得研究成果时的喜悦仍然历历在目。

本课题遇到的最大的困难是发现了在气道平滑肌细胞中CTGF启动子区域没有TGF-β的效应区域,即加入TGF-β后荧光素酶的表达较对照组差异无统计学意义。

众所周知,原代细胞平滑肌细胞的转染效率较低,我们想得到的阴性结果可能是由于(1)转染效率低下;(2)质粒由于某些原因出现错误不能正常工作所引起的;(3)荧光素酶测定试剂盒不能正常工作引起的。

我们首先将质粒转录到HEK293细胞系中,作为肾脏来源的上皮细胞,HEK293细胞因为易培养、增殖快和转染效率高等特点被应用于许多研究中。通过转染HEK293细胞,我们得到了荧光素酶的大量表达。但是由于上皮细胞中TGF-β不能诱导CTGF mRNA的表达,我们并未得到TGF-β诱导的荧光素酶表达量升高。

通过查阅文献,我们发现在NIH 3T3细胞中,TGF-β诱导的CTGF表达是通过CTGF启动子中的Smad结合位点、TGF-β效应元件等调节的。为了验证我们的质粒及研究方法的正确性,我们用NIH 3T3细胞系重复了本研究(阳性对照),发现在NIH 3T3细胞系中,我们的质粒具有TGF-β诱导性。

以上实验证明了我们的质粒是正常工作的,且测定荧光素酶的试剂盒也没有问题。对于转染效率问题,我们尝试了8种不同的转染试剂和3种电转染方法,最终取得了50%的转染效率。

而转染效率的增加并未使我们的研究结果发生改变,我们仍未在CTGF启动子区域发现TGF-β的效应区,这使我们的研究陷入了前所未有的困境中,因为我们已经不知道下一步该如何进行,方向在哪里。

破冰之举

在2017年美国ATS会议期间,我们悉尼的研究团队中通过与荷兰的一位基因工程方面的学者交流,发现可以通过Encode数据库来查询基因启动子及启动子周围的区域对基因表达的调节作用。

破冰之举

于是我们通过Encode数据库试图查找气道平滑肌细胞中CTGF mRNA的启动子调节区域,然而,令人失望的是气道平滑肌细胞相关的数据从未有人发表过。因为我们已经知道肺气道平滑肌细胞和肺成纤维细胞在TGF-β诱导的CTGF的表达方面极其相似,我们退而求其次查询了肺成纤维细胞中CTGF mRNA的调节区域,发现其主要调节区域并不位于启动子中,而是位于启动子上游的区域,因此我们猜想这一区域才是CTGF在气道平滑肌细胞中的调节区域,但我们还未证实这一结论。

但这一历程让我们重新意识到了大会交流的重要性,我们可以通过与其他学者交流拓宽自己的思路,从而更好地进行富有建设的科学研究。

以上是我们课题中遇到的最困难的问题,当然研究过程中还伴随着许多其他问题的发现和解决,通过这些过程,我们更深地体会到了基础研究的不易,但是随着问题的解决,我们拓宽了研究思路,对我们今后的研究具有重要的意义。

更多评论想说就说
  • 全部评论
  • 我的评论
    暂无评论,快来抢沙发吧
      您还没登陆
  • 吸入剂介绍
  • 腹肌锻炼方法
热点标签
本周推荐
重点期刊
文章排行
合作联系
电话:020-62317729
QQ:858622667

欢迎赐稿,来信请至
copd@copdchina.com
关于我们 | 关于本站 | 合作加盟 | 保护隐私权 | 免责条款 | 意见反馈 | 网站地图